Préparation des milieux de culture et stérilisation
Les milieux de culture sont préparés selon les indications du fabricant (pesée, dissolution, ajustement du pH si nécessaire). La stérilisation est réalisée à l'autoclave à 121°C pendant 20 minutes (cycle standard).
Les milieux gélosés sont coulés en boîtes de Petri en conditions stériles (près de la flamme d'un bec Bunsen ou sous hotte à flux laminaire). Les milieux liquides sont répartis en tubes ou flacons stériles.
- Vérifier la date de péremption des milieux déshydratés.
- Ne jamais ouvrir une boîte de Petri ou un tube stérile à l'air libre sans protection.
Techniques d'ensemencement
L'ensemencement permet de déposer des micro-organismes sur ou dans un milieu de culture. Les techniques courantes sont : l'ensemencement par stries (pour isoler des colonies), par inondation (pour compter les micro-organismes), ou par incorporation (pour les anaérobies facultatifs).
L'ensemencement se fait à l'aide d'une anse de platine ou d'une pipette stérile, en travaillant à proximité de la flamme pour éviter les contaminations.
- Flamber l'anse avant et après chaque prélèvement.
- Pour les stries, utiliser une anse bouclée et strier en quadrant pour obtenir des colonies isolées.
Réalisation de dilutions en série
Les dilutions en série (facteur 10) sont utilisées pour réduire la concentration microbienne d'un échantillon afin d'obtenir des colonies dénombrables sur boîte. On prélève 1 mL de la suspension mère que l'on ajoute à 9 mL de diluant stérile (eau peptonée ou solution saline).
Chaque dilution est homogénéisée au vortex ou par agitation manuelle avant de passer à la dilution suivante. Les dilutions sont ensemencées par inondation ou incorporation.
- Utiliser une nouvelle pipette stérile pour chaque dilution.
- Noter le facteur de dilution sur la boîte pour le calcul de la concentration initiale.
Mesure de la densité optique (DO) à 600 nm
La DO à 600 nm est une méthode indirecte pour estimer la biomasse bactérienne en milieu liquide. Plus la culture est dense, plus la DO est élevée. La mesure se fait avec un spectrophotomètre réglé à 600 nm, après avoir blanchi avec le milieu stérile.
La DO est proportionnelle à la concentration cellulaire dans une certaine gamme (généralement DO < 0,8). Au-delà, il faut diluer l'échantillon.
- Homogénéiser la culture avant la mesure.
- Utiliser des cuves en plastique ou en verre adaptées à la longueur d'onde.
Identification morphologique et culturale des micro-organismes
L'identification repose d'abord sur l'observation des caractères culturaux : aspect des colonies (taille, forme, couleur, bord, surface, opacité) sur milieu gélosé. Ensuite, l'observation microscopique après coloration de Gram permet de distinguer les bactéries à Gram positif (violet) et à Gram négatif (rose), et de décrire la forme (cocci, bacilles, spirilles).
L'état frais (observation sans coloration) permet d'observer la mobilité et la morphologie générale. Ces observations sont réalisées au microscope optique (objectif ×40 ou ×100 à immersion).
- Pour la coloration de Gram, respecter les temps : cristal violet (1 min), lugol (1 min), décoloration (alcool 10-20 s), fuchsine (30 s).
- L'état frais se fait entre lame et lamelle, sans coloration, pour observer des cellules vivantes.
Sécurité en laboratoire de biotechnologies
Le travail en laboratoire impose le port d'équipements de protection individuelle (EPI) : blouse fermée, gants à usage unique, lunettes de sécurité. Les micro-organismes manipulés sont de classe de risque 1 (non pathogènes).
Les déchets biologiques (boîtes, pipettes) sont éliminés dans des conteneurs spécifiques avant incinération. Les surfaces de travail sont désinfectées avant et après chaque séance.
- Se laver les mains avant et après manipulation.
- Ne pas manger, boire ou se maquiller au laboratoire.
- En cas de projection, rincer abondamment et prévenir l'enseignant.
