TP Électrophorèse de l'ADN

Durée : 2h30 Niveau : Terminale STL BBB

Objectifs du TP

Comprendre le principe de séparation des fragments d'ADN par électrophorèse
Maîtriser la préparation d'un gel d'agarose et son utilisation
Savoir lire et interpréter un profil électrophorétique
Estimer la taille de fragments d'ADN à l'aide d'un marqueur de taille

CONSIGNES DE SÉCURITÉ OBLIGATOIRES

EPI Obligatoires

• Blouse fermée, manches longues
• Gants nitrile (manipulation du gel et colorant)
• Lunettes de protection (surtout si BET)
• Cheveux attachés

Dangers spécifiques

• BET (Bromure d'Éthidium) : mutagène, cancérigène suspecté
• UV : brûlures oculaires et cutanées
• Électricité : risque d'électrocution (100-150V)
• Agarose chaud : risque de brûlure (60-70°C)

💡 Conseil : De nombreux laboratoires utilisent maintenant le SYBR Safe ou le GelRed en remplacement du BET. Ces colorants sont moins toxiques mais nécessitent tout de même des précautions.

1. Principe de l'électrophorèse sur gel d'agarose

Qu'est-ce que l'électrophorèse ?

L'électrophorèse est une technique de séparation de molécules chargées sous l'effet d'un champ électrique. Les molécules migrent à travers un gel (matrice poreuse) vers l'électrode de charge opposée, à une vitesse qui dépend de leur taille et de leur charge.

Pourquoi l'ADN migre-t-il vers l'anode (+) ?

Charge négative de l'ADN

• L'ADN possède des groupements phosphate (PO₄⁻)
• Ces groupements sont ionisés à pH physiologique
• Chaque nucléotide porte une charge négative
• L'ADN est donc une molécule polyanionique

Conséquence

Sous l'effet du champ électrique, l'ADN chargé négativement est attiré par l'électrode positive (anode) et repoussé par l'électrode négative (cathode).

Cathode (−) → → → ADN → → → Anode (+)

Facteurs influençant la vitesse de migration

📏 Taille des fragments

Les petits fragments migrent plus vite car ils traversent plus facilement les pores du gel.

Relation inverse : plus c'est petit, plus ça va vite

🔌 Voltage appliqué

Un voltage plus élevé accélère la migration mais peut dénaturer l'ADN ou créer un smear.

Optimal : 1-5 V/cm de gel

🧪 Concentration du gel

Plus le gel est concentré, plus les pores sont petits → meilleure séparation des petits fragments.

0.5% à 3% selon les besoins

Schéma de principe

−

CATHODE

(pôle négatif)

GEL D'AGAROSE + TAMPON

→ Migration de l'ADN vers le + →

ANODE

(pôle positif)

Rappel : Les puits de dépôt sont toujours placés du côté de la cathode (−)pour que l'ADN migre vers l'anode (+).

2. Matériel nécessaire

Équipements

•
Cuve d'électrophorèse horizontale
Avec support de gel et peigne
•
Générateur de courant
Réglable 50-150V, avec câbles
•
Trans-illuminateur UV
ou LED bleue (plus sûr)
•
Balance de précision
Pour peser l'agarose
•
Micro-ondes ou plaque chauffante
Pour dissoudre l'agarose
•
Micropipettes
P10 et P20 avec cônes

Réactifs et consommables

•
Agarose (poudre)
Qualité biologie moléculaire
•
Tampon TAE ou TBE (1X)
Pour gel et migration
•
Agent intercalant
BET, SYBR Safe ou GelRed
•
Marqueur de taille ADN
Ex: 100 bp ladder, 1 kb ladder
•
Tampon de charge (Loading buffer)
6X, avec colorant (bleu de bromophénol)
•
Échantillons d'ADN
Produits de PCR, digestion enzymatique...

TAE vs TBE : quel tampon choisir ?

Critère	TAE	TBE
Composition	Tris-Acétate-EDTA	Tris-Borate-EDTA
Pouvoir tampon	Faible	Élevé
Résolution	Bonne	Excellente (petits fragments)
Récupération ADN	✓ Recommandé	Inhibition possible
Usage typique	Clonage, séquençage	Analyse simple, PCR

3. Choix de la concentration en agarose

La concentration en agarose détermine la taille des pores du gel et donc la gamme de taille des fragments qui seront correctement séparés.

Concentration agarose (%)	Taille des pores	Gamme de séparation optimale	Application typique
0.5%	Très grands	5 - 30 kb	ADN génomique, grands fragments
0.8%	Grands	1 - 12 kb	Plasmides, grands produits PCR
1.0%	Moyens	500 pb - 7 kb	⭐ Usage standard
1.5%	Petits	200 pb - 3 kb	Produits PCR moyens
2.0%	Très petits	100 pb - 2 kb	Petits produits PCR, RFLP
3.0%	Minuscules	50 - 500 pb	Très petits fragments, primers

💡 Règle pratique : Pour un TP standard avec des produits PCR de 200 pb à 2 kb, utilisez un gel à 1% ou 1.5%. En cas de doute, commencez par 1%.

Calcul de la quantité d'agarose

Formule : Masse agarose (g) = Concentration (%) × Volume tampon (mL) / 100

Exemple 1 : Gel 1% de 50 mL

Masse = 1 × 50 / 100 = 0.5 g

Exemple 2 : Gel 2% de 100 mL

Masse = 2 × 100 / 100 = 2.0 g

4. Protocole step-by-step

Préparation du gel d'agarose

(≈ 20 min)

Préparer le moule

Positionner le support de gel dans le moule, vérifier l'étanchéité (ruban adhésif ou barrettes). Placer le peigne.

Peser l'agarose

Peser la quantité d'agarose nécessaire selon le volume et la concentration souhaités.

Ex: Pour 50 mL de gel 1% → peser 0.5 g d'agarose

Dissoudre dans le tampon

Ajouter l'agarose au tampon TAE/TBE 1X dans un erlenmeyer. Chauffer au micro-ondes par pulses de 20-30s jusqu'à dissolution complète (solution transparente sans particules).

Attention : L'agarose chaud peut projeter ! Ne jamais fermer hermétiquement le récipient.

Laisser refroidir

Attendre que la solution atteigne environ 50-60°C (supportable au toucher mais encore liquide). C'est le moment d'ajouter le colorant si nécessaire.

Ajouter l'agent intercalant (optionnel)

Si coloration dans le gel : ajouter le BET/SYBR Safe selon les recommandations du fabricant. Homogénéiser délicatement.

Dosage typique : 0.5 µg/mL de BET ou selon notice SYBR Safe

Couler le gel

Verser lentement l'agarose dans le moule. Éliminer les bulles d'air avec un cône de pipette ou en soufflant doucement.

Erreur fréquente : Les bulles créent des zones sans gel où les échantillons peuvent diffuser !

Solidification

Laisser polymériser à température ambiante pendant 20-30 minutes. Le gel devient opaque/translucide quand il est prêt.

Retirer le peigne

Retirer délicatement le peigne en tirant verticalement, sans mouvement latéral. Les puits doivent avoir des bords nets.

Dépôt des échantillons

(≈ 15 min)

Installer le gel dans la cuve

Placer le gel solidifié dans la cuve d'électrophorèse. Les puits doivent être côté cathode (−).

Ajouter le tampon de migration

Verser le tampon TAE/TBE 1X jusqu'à recouvrir le gel de 2-3 mm. Le gel doit être complètement immergé.

Préparer les échantillons

Mélanger chaque échantillon d'ADN avec du tampon de charge (loading buffer) 6X.

Proportions typiques :

• 5 µL d'échantillon + 1 µL de loading buffer 6X
• Ou ratio 5:1 (échantillon:buffer)

Déposer le marqueur de taille

Dans le premier puits (ou dernier), déposer 5 µL de marqueur de taille (ladder). Noter la position !

Déposer les échantillons

Déposer délicatement chaque échantillon dans les puits. La pipette doit être juste au-dessus du puits, sans toucher les parois. Le loading buffer (plus dense) fait couler l'échantillon au fond du puits.

Astuce : Maintenir la pipette à 45° et expulser lentement pour éviter les bulles.

Noter le plan de dépôt

Établir un schéma clair de la position de chaque échantillon. C'est ESSENTIEL pour l'interprétation !

Exemple de plan de dépôt :

T+

T−

M = Marqueur, E1-3 = Échantillons, T+ = Témoin +, T− = Témoin −

Migration électrophorétique

(≈ 30-60 min)

Connecter le générateur

Brancher les câbles : noir (−) côté des puits, rouge (+) côté opposé.

⚠️ Vérifier l'orientation !

Si l'ADN ne migre pas vers le + = les câbles sont inversés = l'ADN sort des puits !

Régler le voltage

Appliquer 80-120V (environ 5V/cm de gel). Un voltage trop élevé crée de la chaleur et déforme les bandes.

✓ 100V pour gel de 10 cm

✗ 200V = surchauffe, smear

Vérifier la migration

Des bulles doivent apparaître aux électrodes (électrolyse de l'eau). Le colorant bleu du loading buffer migre vers le +.

Surveiller la progression

Le bleu de bromophénol (≈ 300 pb dans gel 1%) sert de repère. Arrêter avant qu'il n'atteigne le bord du gel.

Temps indicatif : 30-45 min à 100V pour une migration de 5-6 cm

Arrêter la migration

Éteindre le générateur AVANT de débrancher les câbles. Ne jamais manipuler les câbles sous tension !

Révélation et visualisation

(≈ 15 min)

Coloration post-électrophorèse (si non incluse dans le gel)

Immerger le gel dans une solution de colorant (BET 0.5 µg/mL ou SYBR Safe dilué) pendant 15-30 min.

Rinçage (optionnel)

Rincer rapidement à l'eau distillée pour réduire le bruit de fond (surtout avec BET).

Visualisation UV

Placer le gel sur le trans-illuminateur UV (302 nm ou 365 nm). L'ADN fluorescent apparaît en orange/vert.

SÉCURITÉ UV :

Porter des lunettes UV ou écran de protection
Limiter le temps d'exposition (quelques secondes)
Ne JAMAIS regarder directement les UV

Photographie du gel

Prendre une photo avec le système d'imagerie ou un smartphone (filtre orange recommandé). Cette image servira à l'analyse.

5. Lecture et interprétation du gel

Schéma d'un gel après migration (vue sous UV)

← CATHODE (−) | PuitsSens de migration →

T+

T−

Aucune bande

3000 pb2000 pb1500 pb1000 pb750 pb500 pb250 pb

ANODE (+) →

Les bandes les plus intenses correspondent à une plus grande quantité d'ADN.
La bande à 1000 pb du marqueur est souvent plus intense (repère visuel).

Comment estimer la taille d'un fragment ?

1Identifier les bandes du marqueur de taille (ladder) et noter leurs positions.
2Mesurer la distance de migration de chaque bande du marqueur depuis le puits.
3Tracer une courbe d'étalonnage : log(taille en pb) en fonction de la distance de migration.
4Mesurer la distance de migration de votre fragment inconnu.
5Reporter cette distance sur la courbe pour estimer la taille du fragment.

💡 Estimation rapide : Si votre fragment migre entre deux bandes du marqueur (ex: entre 500 et 750 pb), sa taille est comprise entre ces deux valeurs. Plus il est proche d'une bande, plus sa taille est proche de cette référence.

Interprétation des profils types

Résultat positif (PCR)

Une bande unique à la taille attendue = amplification réussie du fragment cible.

Résultat négatif

Absence de bande = pas d'amplification. Vérifier : ADN matrice, amorces, Taq, programme PCR.

Bandes multiples

Plusieurs bandes = amplification non spécifique OU digestion enzymatique (attendue). Vérifier les témoins.

Smear (traînée)

Traînée diffuse = ADN dégradé, surcharge ou voltage trop élevé. Pas exploitable.

6. Résultats attendus

Ce que vous devez observer

Marqueur de taille : Échelle de bandes bien séparées, bande 1000 pb plus intense
Témoin positif : Bande à la taille attendue (valide le protocole)
Témoin négatif : Aucune bande (valide l'absence de contamination)
Échantillons : Bandes nettes correspondant aux fragments amplifiés ou digérés

Critères de qualité d'un bon gel

✓ Bandes nettes et fines

Pas de diffusion, contours bien définis

✓ Migration rectiligne

Les bandes sont horizontales, pas de "smile"

✓ Bonne séparation

Les bandes sont distinctes les unes des autres

✓ Faible bruit de fond

Le fond du gel est sombre et uniforme

7. Erreurs fréquentes et solutions

Bulles d'air dans le gel

Problème : Les bulles créent des zones sans agarose, les échantillons diffusent ou migrent de façon irrégulière.

Solution : Éliminer les bulles avec un cône de pipette AVANT la solidification. Couler lentement. Utiliser agarose bien dissous.

Migration inversée (ADN sort des puits)

Problème : Les câbles sont inversés. L'ADN migre vers la cathode et sort du gel.

Solution : Toujours vérifier : puits côté noir (−), migration vers le rouge (+). Retenir : "Run to Red".

Smear (traînée diffuse)

Problème : Pas de bandes distinctes, juste une traînée continue.

Causes possibles :

ADN dégradé (DNases, mauvaise conservation)
Surcharge du puits (trop d'ADN)
Voltage trop élevé (surchauffe)
Tampon épuisé (réutilisé trop de fois)

Bandes "souriantes" (smile effect)

Problème : Les bandes aux extrémités migrent plus vite que celles au centre, créant un "sourire".

Solution : Réduire le voltage. S'assurer que le gel est bien recouvert de tampon. Utiliser un tampon frais.

Pas de bandes visibles

Problème : Le gel semble vide même avec les témoins.

Causes possibles :

Colorant absent ou dégradé
UV éteints ou de mauvaise longueur d'onde
Échantillons non chargés (oubli de loading buffer)
Migration trop longue (ADN sorti du gel)
Quantité d'ADN trop faible

Échantillon qui flotte hors du puits

Problème : L'échantillon ne reste pas au fond du puits et diffuse dans le tampon.

Solution : Ajouter suffisamment de loading buffer (le glycérol alourdit l'échantillon). Déposer lentement au fond du puits.

8. Récapitulatif - Points clés à retenir

Principes fondamentaux

• L'ADN est chargé négativement (groupements phosphate)
• Migration vers l'anode (+)
• Les petits fragments migrent plus vite
• La concentration en agarose détermine la résolution

Bonnes pratiques

• Toujours inclure un marqueur de taille
• Utiliser des témoins (+ et −)
• Noter le plan de dépôt
• Vérifier l'orientation des câbles

Formule à retenir

Masse agarose (g) = Concentration (%) × Volume (mL) / 100

Exemple : Gel 1.5% de 60 mL → 1.5 × 60 / 100 = 0.9 g

Questions fréquentes

Pourquoi mes bandes sont-elles floues ?

Plusieurs causes possibles : surcharge du puits, voltage trop élevé, migration trop longue, ou ADN partiellement dégradé. Essayez de réduire la quantité d'ADN et le voltage.

Puis-je réutiliser le tampon de migration ?

Oui, mais limité à 3-4 fois maximum. Le pouvoir tampon diminue avec les utilisations (surtout pour le TAE). Remplacer si la migration devient irrégulière ou lente.

Comment récupérer l'ADN d'une bande ?

Découper la bande sous UV (exposition minimale !), puis utiliser un kit d'extraction sur gel (gel extraction kit). Le TAE donne de meilleurs rendements que le TBE pour cette application.

Quelle est la différence entre BET et SYBR Safe ?

Le BET (bromure d'éthidium) est un agent intercalant mutagène, très toxique. Le SYBR Safe est une alternative moins toxique, nécessitant une LED bleue pour la visualisation. Les deux s'intercalent dans l'ADN double brin et fluorescent sous UV ou lumière bleue.

TP rédigé pour le programme de Terminale STL spécialité BBB