TP Dosage Enzymatique
Cinetique et activite enzymatique
Introduction
Le dosage enzymatique est une technique fondamentale en biotechnologie permettant de mesurer l'activite d'une enzyme. Cette activite est liee a la vitesse a laquelle l'enzyme transforme son substrat en produit. La mesure se fait generalement par spectrophotometrie en suivant l'apparition du produit ou la disparition du substrat au cours du temps.
Ce TP vous permettra de determiner les parametres cinetiques d'une enzyme (Vmax et Km) et de calculer son activite specifique, essentielle pour caracteriser la purete et l'efficacite d'une preparation enzymatique.
Enzymes couramment etudiees
- Phosphatase alcaline (PAL) - hydrolyse le pNPP
- Lactate deshydrogenase (LDH) - oxyde le lactate
- Peroxydase (HRP) - oxyde les substrats avec H2O2
- beta-galactosidase - hydrolyse le lactose/ONPG
- Amylase - hydrolyse l'amidon
Applications du dosage enzymatique
- Diagnostic medical (enzymes seriques)
- Controle qualite en industrie alimentaire
- Suivi de purification proteique
- Tests ELISA (enzymes de detection)
- Etude des inhibiteurs enzymatiques
Objectifs pédagogiques
Savoirs (Connaissances)
- Comprendre le modele de Michaelis-Menten et ses parametres (Vmax, Km)
- Connaitre les unites enzymatiques (UI, katal, activite specifique)
- Maitriser le principe de la spectrophotometrie UV-visible
- Identifier les facteurs influencant l'activite enzymatique
Savoir-faire (Competences)
- Realiser une gamme etalon et tracer une droite de regression
- Mesurer une vitesse initiale de reaction enzymatique
- Tracer et exploiter un graphique de Lineweaver-Burk
- Calculer l'activite enzymatique et l'activite specifique
Securite au laboratoire
EPI obligatoires
Lunettes
Gants nitrile
Blouse
Pictogrammes GHS des reactifs
Irritant
(Tampons)
Corrosif
(NaOH, HCl)
Precautions specifiques
- Manipuler les solutions de substrat chromogene (pNPP, ONPG) avec precaution
- Eviter le contact des tampons avec la peau et les yeux
- Eliminer les dechets enzymatiques dans les conteneurs adaptes
- Ne jamais pipeter a la bouche - toujours utiliser une poire
Principe : Cinetique de Michaelis-Menten
Le modele de Michaelis-Menten décrit la relation entre la vitesse initiale d'une reaction enzymatique (v0) et la concentration en substrat [S]. Ce modele repose sur l'hypothese de l'equilibre rapide :
E + S ⇌ ES → E + P
Enzyme + Substrat ⇌ Complexe enzyme-substrat → Enzyme + Produit
Equation de Michaelis-Menten
v₀ = (Vmax × [S]) / (Km + [S])
Vmax : Vitesse maximale atteinte quand l'enzyme est saturee en substrat (toutes les molecules d'enzyme sont sous forme ES)
Km : Constante de Michaelis = concentration en substrat pour laquelle v₀ = Vmax/2. Reflete l'affinite enzyme-substrat
Interpretation du Km
- • Km faible → Forte affinite enzyme-substrat (l'enzyme se lie facilement)
- • Km élève → Faible affinite enzyme-substrat (plus de substrat necessaire)
- • Le Km est caracteristique du couple enzyme-substrat
- • Unite : mole/L (ou mmol/L, micromol/L)
Courbe de Michaelis-Menten
La courbe v₀ = f([S]) est une hyperbole rectangulaire
Materiel et reactifs
Equipements
| Equipement | Qte |
|---|---|
| Spectrophotometre UV-Vis | 1 |
| Cuves spectro (plastique ou quartz) | 10 |
| Micropipettes P20, P200, P1000 | 1 jeu |
| Cones steriles | 30+ |
| Tubes Eppendorf 1.5 mL | 15 |
| Portoir pour tubes | 2 |
| Bain-marie thermostate (37°C) | 1 |
| Chronometre | 1 |
| Vortex | 1 |
Reactifs (exemple : Phosphatase alcaline)
| Reactif | Concentration |
|---|---|
| Tampon Tris-HCl pH 8.5 | 100 mM |
| MgCl₂ | 5 mM |
| pNPP (para-nitrophenyl-phosphate) | 10 mM |
| Solution mere pNP (etalon) | 1 mM |
| NaOH (arret reaction) | 0.5 M |
| Solution enzymatique (PAL) | A diluer |
| Eau distillee | qsp |
Note : Le pNPP (incolore) est hydrolyse par la PAL en pNP (jaune) et phosphate inorganique. L'absorbance du pNP est mesuree a 405 nm.
Protocole A : Gamme etalon pNP
La gamme etalon permet d'etablir la relation entre l'absorbance mesuree et la concentration en produit (pNP). Elle sert a convertir les DO en concentrations.
| Tube | Blanc | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| pNP 1 mM (microL) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| Tampon (microL) | 900 | 880 | 860 | 840 | 820 | 800 |
| NaOH 0.5M (microL) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Volume final (microL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| [pNP] finale (micromol/L) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
Preparation des tubes
- • Preparer 6 tubes Eppendorf etiquetes (Blanc, 1-5)
- • Ajouter le tampon Tris-HCl selon le tableau
- • Ajouter la solution pNP 1 mM selon le tableau
- • Ajouter 100 microL de NaOH 0.5 M (developpe la couleur jaune)
Lecture spectrophotometrique
- • Regler le spectrophotometre a 405 nm
- • Faire le zero avec le blanc
- • Mesurer l'absorbance (DO) de chaque tube
- • Noter les valeurs dans un tableau
Trace de la droite etalon
- • Tracer DO = f([pNP]) sur papier millimetre ou tableur
- • Verifier la linearite (R² > 0.99)
- • Determiner l'equation de la droite : DO = a × [pNP] + b
- • Le coefficient "a" correspond au coefficient d'extinction molaire epsilon
Protocole B : Cinetique enzymatique
Cette partie permet de mesurer la vitesse initiale v₀ pour differentes concentrations en substrat et de determiner Vmax et Km.
| Tube | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Tampon Tris-HCl (microL) | 790 | 780 | 750 | 700 | 600 | 400 |
| pNPP 10 mM (microL) | 10 | 20 | 50 | 100 | 200 | 400 |
| MgCl₂ 50 mM (microL) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Enzyme PAL (microL) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Volume final (microL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| [pNPP] finale (mM) | 0.1 | 0.2 | 0.5 | 1.0 | 2.0 | 4.0 |
Pre-incubation
- • Preparer les tubes avec tampon, pNPP et MgCl₂
- • Pre-incuber 5 min a 37°C au bain-marie
- • Preparer le spectrophotometre (405 nm, cinetique)
Demarrage de la reaction
- • Ajouter 100 microL d'enzyme (demarrage)
- • Melanger immediatement par inversion (3x)
- • Declencher le chronometre
- • Transferer dans la cuve spectro thermostatee
Mesure cinetique
- • Mesurer la DO a 405 nm toutes les 30 secondes
- • Pendant 5 minutes minimum
- • OU utiliser le mode cinetique du spectrophotometre
- • Noter les valeurs ou exporter les donnees
Arret de la reaction (optionnel)
- • Ajouter 200 microL de NaOH 0.5 M pour stopper la reaction
- • Lire la DO finale (point final)
- • Cette méthode est utilisee pour les mesures en point final
Calculs : Activite enzymatique
1. Calcul de la vitesse initiale (v₀)
La vitesse initiale correspond a la pente de la partie lineaire de la courbe DO = f(temps) au debut de la reaction.
v₀ = delta DO / delta t (DO/min)
Prendre la pente dans les 2-3 premieres minutes (phase lineaire)
2. Conversion en concentration de produit
Utiliser la droite etalon ou le coefficient d'extinction molaire epsilon.
[pNP] = DO / (epsilon × l)
Ou : epsilon = 18 300 M-1.cm-1 pour pNP a 405 nm (pH alcalin)
l = trajet optique = 1 cm
3. Unite internationale (UI)
1 UI = 1 micromol de substrat transforme par minute
Activite enzymatique (UI/mL) :
A (UI/mL) = (v₀ × Vtotal) / (epsilon × l × Venzyme)
4. Activite specifique
L'activite specifique permet de comparer la purete de differentes preparations enzymatiques.
AS (UI/mg) = Activite totale (UI) / Masse de proteines (mg)
Plus l'AS est élèvee, plus l'enzyme est pure
5. Le katal (unite SI)
1 kat = 1 mol de substrat transforme par seconde
Conversion : 1 UI = 16.67 nkat (nanokatal)
Interpretation graphique : Lineweaver-Burk
La representation en double inverse (Lineweaver-Burk) permet de determiner graphiquement Vmax et Km a partir d'une droite.
1/v₀ = (Km/Vmax) × (1/[S]) + 1/Vmax
Forme y = ax + b avec y = 1/v₀ et x = 1/[S]
Graphique de Lineweaver-Burk (double inverse)
Ordonnee a l'origine
L'intersection avec l'axe des ordonnees (1/[S] = 0) donne 1/Vmax
→ Vmax = 1 / (ordonnee a l'origine)
Abscisse a l'origine
L'intersection avec l'axe des abscisses (1/v₀ = 0) donne -1/Km
→ Km = -1 / (abscisse a l'origine)
Pieges a eviter
Temperature
- Ne pas travailler a temperature ambiante variable
- Oublier de pre-incuber substrat et enzyme
- Utiliser un bain-marie ou bloc chauffant thermostate
pH
- Utiliser un tampon au mauvais pH
- Oublier que le pH optimal varie selon l'enzyme
- Verifier le pH du tampon avant utilisation
Dilutions
- Enzyme trop concentree → reaction trop rapide
- Enzyme trop diluee → signal trop faible
- Ajuster la dilution pour delta DO/min = 0.05-0.3
Temps de mesure
- Mesurer v₀ sur la phase plateau (substrat epuise)
- Ne pas demarrer le chrono a l'ajout d'enzyme
- Prendre la pente initiale (premieres 2-3 min)
Gamme etalon
- Oublier de faire le blanc
- Extrapoler hors de la gamme de linearite
- Verifier R² > 0.99 pour la droite etalon
Spectrophotometre
- Cuves rayees ou sales (bulles, traces)
- Longueur d'onde incorrecte
- Rincer les cuves entre chaque mesure
Questions d'exploitation (Bac STL)
Q1. Signification du Km
Que represente le Km et comment l'interpreter biologiquement ?
Le Km (constante de Michaelis) represente la concentration en substrat pour laquelle la vitesse de reaction est egale a la moitie de Vmax. C'est une mesure de l'affinite enzyme-substrat :
- • Km faible (ex: 0.01 mM) → l'enzyme atteint facilement Vmax/2 avec peu de substrat = forte affinite
- • Km élève (ex: 10 mM) → il faut beaucoup de substrat = faible affinite
Q2. Influence de la concentration en enzyme
Si on double la concentration en enzyme, qu'advient-il de Vmax et Km ?
Vmax est doublee : Vmax = kcat × [E]totale
Si [E] double, Vmax double (plus de molecules d'enzyme = plus de produit forme par unite de temps).
Km reste inchange : le Km est une caracteristique intrinseque du couple enzyme-substrat, independante de la concentration en enzyme.
Q3. Calcul d'activite specifique
Un extrait enzymatique de 2 mL contient 5 mg de proteines totales. L'activite mesuree est de 120 UI. Calculez l'activite specifique.
AS = Activite totale / Masse proteines
AS = 120 UI / 5 mg = 24 UI/mg
Cette valeur permet de suivre la purification : plus l'AS augmente, plus l'enzyme est pure.
Q4. Avantages du graphique de Lineweaver-Burk
Pourquoi utiliser la representation en double inverse plutot que la courbe hyperbolique directe ?
- • La representation 1/v₀ = f(1/[S]) est une droite (plus facile a tracer)
- • Determination graphique directe de Vmax et Km par lecture des intercepts
- • Permet de detecter les types d'inhibition (competitif, non-competitif)
- • Regression lineaire plus fiable que l'ajustement d'une hyperbole
Q5. Effet d'un inhibiteur competitif
Comment un inhibiteur competitif modifie-t-il Vmax et Km ? Comment le detecter sur un graphique de Lineweaver-Burk ?
Un inhibiteur competitif se fixe au site actif de l'enzyme et entre en competition avec le substrat :
- • Vmax inchange : a tres forte [S], le substrat deplace l'inhibiteur
- • Km apparent augmente : il faut plus de substrat pour atteindre Vmax/2
- • Sur Lineweaver-Burk : meme ordonnee a l'origine (1/Vmax), pente plus forte
Q6. Conditions de mesure de v₀
Pourquoi est-il essentiel de mesurer la vitesse INITIALE de reaction ?
La vitesse initiale v₀ est mesuree au tout debut de la reaction car :
- • La [S] est connue et constante (pas encore consommee)
- • L'inhibition par le produit est negligeable
- • La reaction est en regime stationnaire
- • Permet d'appliquer l'equation de Michaelis-Menten
Astuces pour reussir votre TP
Organisation du temps
- • Preparer la gamme etalon EN PREMIER (10 min)
- • Pendant les lectures, preparer les tubes cinetique
- • Planifier l'ordre des mesures cinetiques
Qualite des mesures
- • Faire 3 repetitions pour chaque point
- • Verifier que DO < 2 (zone de linearite du spectro)
- • Homogeneiser avant chaque lecture
Trace des graphiques
- • Utiliser un tableur (Excel, Calc) pour les calculs
- • Ajouter les barres d'erreur sur les points
- • Afficher l'equation de regression et R²
Compte-rendu
- • Inclure les deux graphiques (M-M et L-B)
- • Indiquer Vmax et Km avec unites
- • Discuter les sources d'erreur possibles
Criteres d'evaluation (Bac STL)
| Competence evaluee | Points | Indicateurs de réussite |
|---|---|---|
| S'approprier | 4 | Comprehension du principe, identification du materiel, unites |
| Analyser | 4 | Calculs corrects (v₀, activite, AS), equation M-M |
| Realiser | 8 | Gestes techniques (pipetage, spectro), respect du protocole, securite |
| Valider | 4 | Interpretation des graphiques, determination Vmax/Km, analyse critique |
| Total | 20 |
